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    minerva-biolabs常見問題

    發(fā)布時間: 2022-12-07  點(diǎn)擊次數(shù): 791次

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    minerva-biolabs常見問題與解答

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     Minerva-biolabs常見問題

    蛋白酶K

    提供多少毫克蛋白酶?

    每小瓶蛋白酶K(目錄號56-0002)含有11 mg酶,約為30U/mg,再懸浮在550µl所含的再水合緩沖液中后,其濃度為20 mg/ml

    你推薦什么樣的培養(yǎng)條件?DNA提取試劑(Venor®GeM樣品制備試劑盒)建議添加蛋白酶K,然后繼續(xù)提取(10分鐘,70°C溫育)。這難道不會給酶足夠的時間來工作并可能降解它嗎?

    在我們(廣泛)測試的方案中,蛋白酶K的孵育與樣品裂解同時進(jìn)行(您提到的步驟是在70°C10分鐘)。其想法是將裂解和蛋白酶K處理結(jié)合在一個步驟中,從而使方案盡可能短而有效。我們的數(shù)據(jù)(和質(zhì)量控制)表明,這種處理對相對復(fù)雜的基質(zhì)非常有效,表明在短的培養(yǎng)時間(和酶過量!)下可以忽略變性。例如,對于更復(fù)雜的基質(zhì)如組織,我們建議分離提取/裂解步驟和蛋白酶K處理,并在酶的最佳溫度50-56°C下進(jìn)行蛋白酶K處理。。

    我在用Venor®GeM樣品制備試劑盒分離支原體DNA時遇到問題。由于樣品的特殊性質(zhì),有時會出現(xiàn)柱堵塞的問題。有時樣品中出現(xiàn)白色薄片(可能是有機(jī)來源),離心后留在上清液中,從而堵塞柱。

    有時在含有較高蛋白質(zhì)量(例如疫苗、高血清濃度等)的樣品中觀察到柱堵塞。即使蛋白質(zhì)可能不是主要成分,它們也可能參與蛋白質(zhì)和其他成分之間復(fù)合物的形成。我們建議根據(jù)Venor®GeM樣品制備試劑盒手冊的說明嘗試蛋白酶K處理(70°C培養(yǎng)步驟之前的可選步驟)。

    Venor®GeM樣品制備套件

    我在用Venor®GeM樣品制備試劑盒分離支原體DNA時遇到問題。由于樣品的特殊性質(zhì),有時會出現(xiàn)柱堵塞的問題。有時樣品中出現(xiàn)白色薄片(可能是有機(jī)來源),離心后留在上清液中,從而堵塞柱。

    有時在含有較高蛋白質(zhì)量(例如疫苗、高血清濃度等)的樣品中觀察到柱堵塞。即使蛋白質(zhì)可能不是主要成分,它們也可能參與蛋白質(zhì)和其他成分之間復(fù)合物的形成。我們建議根據(jù)Venor®GeM樣品制備試劑盒手冊的說明嘗試蛋白酶K處理(70°C培養(yǎng)步驟之前的可選步驟)。

    我們將對EP合規(guī)性進(jìn)行支原體檢測。因此,我們計(jì)劃使用Venor®GeM樣品制備試劑盒從細(xì)胞上清液中提取支原體DNA。然而,我們需要將一些上清液冷凍在-20oC。你建議什么:從所有樣本中提取DNA并冷凍它們,或者在95oC下處理上清液(穩(wěn)定步驟)并冷凍它們?我們能把它們冷凍多久?

    我們強(qiáng)烈建議在取樣后直接加熱滅活樣品。如果你選擇冷凍,DNase在解凍階段會活躍,降解低拷貝數(shù)的支原體DNA。熱滅活后,您可以保存樣本,甚至可以在2-8°C的溫度下保存一周,并在室溫下無限制地處理它們。兩種版本都同樣有用:熱滅活或DNA提取,都是在采樣后立即進(jìn)行。

    對于這兩個版本,您可以將樣品儲存在<-18°C的溫度下至少1年。

    Venor®GeM產(chǎn)品線(用于常規(guī)PCR

    適用于所有Venor®GeM支原體檢測試劑盒

    該試劑盒可檢測到多少種支原體?

    基于引物基因組序列比對,我們的試劑盒可以檢測到至少110種屬于軟體動物綱的物種(瘦子、支原體、螺旋體、支原體),其中約165種是文獻(xiàn)中提到的物種。然而,對于許多不太常見的物種,沒有可靠的數(shù)據(jù)或序列信息。因此,我們不能對這些物種的試劑盒特異性做出任何聲明。

    重要的是,我們可以檢測出版物中提到的所有物種作為重要的細(xì)胞培養(yǎng)污染物和許多其他污染物。

    適用于所有Venor®GeM支原體檢測試劑盒

    內(nèi)部控制DNA(或內(nèi)部擴(kuò)增控制)的功能是什么?

    內(nèi)部控制表示在同一PCR反應(yīng)管中與靶擴(kuò)增(支原體)平行發(fā)生的第二擴(kuò)增反應(yīng)。內(nèi)部控制擴(kuò)增子的出現(xiàn)表明條件是PCR允許的(沒有PCR抑制)。因此,內(nèi)部控制DNA是一種有用的驗(yàn)證工具,有助于排除假陰性。

    Venor®GeM試劑盒中,內(nèi)部控制與目標(biāo)擴(kuò)增反應(yīng)的競爭較弱。結(jié)果,目標(biāo)DNA的強(qiáng)擴(kuò)增(例如強(qiáng)污染)可能導(dǎo)致內(nèi)部控制擴(kuò)增失敗。因此,在嚴(yán)重污染的樣本或非常有效的PCR擴(kuò)增的情況下,缺失內(nèi)部控制是全正常的情況。因此,內(nèi)部控制的結(jié)果與陽性PCR反應(yīng)無關(guān)。

    適用于所有Venor®GeM支原體檢測試劑盒

    我想在95°C下冷凍滅活步驟后的上清液,稍后再使用。在什么溫度下,我可以保存這些樣品多長時間?

    根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn),樣品可以在-20°C下安全儲存至少1年。還可以將滅活上清液在RT下儲存5天或在+2-+8°C下儲存14天。

    適用于所有Venor®GeM支原體檢測試劑盒

    我們使用Venor®GeM qEP進(jìn)行的檢測一直效果良好。然而,這次陽性對照失敗了。補(bǔ)液后,試劑盒按照方案中的建議正確儲存。可能出了什么問題?您有哪些建議可以確保陽性對照的良好表現(xiàn)?

    陽性對照作為一個小瓶提供。再水合后,只要您使用無DNase移液管端并在清潔的工作區(qū)域工作,該試劑在頻繁的解凍/冷凍循環(huán)中是穩(wěn)定的。

    然而,等分補(bǔ)充水分的陽性對照可能會有所幫助。

    我們建議將其等分到PCR管中,因?yàn)樗鼈兺ǔJ歉蓛舻摹oDNase的和低結(jié)合性的。

    適用于所有Venor®GeM支原體檢測試劑盒

    在使用Venor®GeM支原體檢測試劑盒檢測支原體之前,請告訴我在沒有抗生素的情況下培養(yǎng)細(xì)胞48小時是否足夠?

    如果您的抗生素沒有顯示出對支原體的活性,則可以在沒有任何事先無抗生素培養(yǎng)的情況下進(jìn)行測試,并將提供有關(guān)支原體污染的可靠信息。

    在支原體活性抗生素的情況下,我們知道,在無抗生素培養(yǎng)的5天內(nèi),大多數(shù)支原體種類的微小數(shù)量將增長到易于檢測的水平。快速生長的支原體種類可能在48小時后可被檢測到。總之,在沒有此類抗生素的情況下,等待5天培養(yǎng)物生長將給您帶來可靠的結(jié)果。請記住,PCR是最敏感的方法。使用其他技術(shù),您可能需要培養(yǎng)和延遲測試更長時間。

    適用于所有Venor®GeM支原體檢測試劑盒

    Venor®GeM Classic手冊指出,在培養(yǎng)物中使用霉素和/或霉素不會影響測試。然而,我們使用的是抗生素抗真菌溶液,除了霉素和霉素外,還含有性霉素B。在進(jìn)行支原體測試之前,我們是否應(yīng)該在沒有抗生素抗真菌的情況下培養(yǎng)細(xì)胞?

    性霉素B對支原體沒有活性,不應(yīng)影響支原體檢測。

    補(bǔ)充抗生素抗真菌溶液的培養(yǎng)物可直接使用Venor®GeM Classic試劑盒進(jìn)行測試。

    適用于所有Venor®GeM支原體檢測試劑盒

    我們在媒體上使用了大霉素,我想知道這是否會干擾測試。你指出霉素和霉素不會顯著改變測試的敏感性。大霉素會干擾嗎?

    盡管PCR檢測本身不會受到大霉素的影響,但支原體在樣本中生長的能力顯然會受到影響。大霉素對支原體有活性,不幸的是導(dǎo)致耐藥菌株的發(fā)展很快。因此,如果可能,我們通常建議在培養(yǎng)1周后,在沒有抗生素添加劑的情況下測試培養(yǎng)物。

    適用于所有Venor®GeM支原體檢測試劑盒

    我們希望在解凍后直接用Venor®GeM Advance測試細(xì)胞(在液氮中冷凍保存),而無需事先培養(yǎng)。這可能嗎?

    用我們的PCR檢測方法(任何試劑盒)直接檢測解凍樣品或冷凍樣品通常是不可能的。原因是冷凍介質(zhì)中通常含有高濃度的FBSDMSO。這兩種物質(zhì)都抑制PCR反應(yīng)。對于這樣的樣品,PCRDNA提取是必要的。

    僅適用于Venor®GeM Classic

    我根據(jù)方案進(jìn)行的PCR沒有檢測到任何條帶(既沒有陽性對照,也沒有內(nèi)部DNA對照)。

    試劑都是新鮮重懸的,沒有反復(fù)冷凍和解凍。我使用了熱啟動Taq聚合酶,它在其他PCR反應(yīng)中表現(xiàn)良好。

    出了什么問題?

    對于Venor®GeM Classic,我們建議使用熱啟動DNA Taq聚合酶。

    使用在其他PCR設(shè)置中表現(xiàn)良好的聚合酶并不一定保證該特定PCR分析的成功。

    套件中提供的緩沖液對于底漆的正常工作至關(guān)重要。

    并非所有聚合酶在試劑盒緩沖液和條件下都表現(xiàn)良好。

    沒有擴(kuò)增通常表明酶與試劑盒不兼容。

    僅適用于Venor®GeM ClassicOneStepAdvance

    一些樣本顯示出感興趣基因(支原體)的強(qiáng)條帶,而內(nèi)部對照沒有條帶。我的樣本是否被污染或PCR運(yùn)行無效?

    只有陰性樣本才需要出現(xiàn)內(nèi)部控制帶。當(dāng)你的樣本被支原體嚴(yán)重污染時,它的DNA會被成比例地?cái)U(kuò)增。在這些條件下,由于試劑競爭,內(nèi)部控制帶逐漸消失。因此,您可以得出結(jié)論,您的PCR運(yùn)行是有效的,不幸的是,您的樣本受到嚴(yán)重污染。

    僅適用于Venor®GeM ClassicOneStepAdvance

    如產(chǎn)品手冊所示,我們使用Venor®GeM ClassicMinerva BiolabsTaq聚合酶。我們無法檢測到陽性或陰性控制通道中的任何頻帶(內(nèi)部控制未被放大)。原因可能是什么?

    -PCR反應(yīng)失敗的可能原因中,我們建議考慮使用中的PCR循環(huán)儀可能存在技術(shù)問題的可能性。這不是一個遙遠(yuǎn)的可能性。為了評估循環(huán)儀的性能,我們建議測試具有相同PCR設(shè)置的另一個循環(huán)儀或具有相同循環(huán)儀的另一PCR設(shè)置。

    -陽性對照DNA的再水合不正確(例如體積)

    -PC被正確地再水合,但進(jìn)行了太多的冷凍/解凍循環(huán),或由于DNase污染而發(fā)生DNA降解。

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